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本试剂盒是一种先进的自杀基因阳性选择克隆系统，可以高效克隆平末端PCR产物和任何具有平末端的DNA片段。该试剂盒对磷酸化或非磷酸化的DNA片段都有效。阳性选择载体和插入片段连接仅需5分钟即可获得超过95%的阳性重组克隆。由具有校正活性的聚合酶（如：Pfu polymerase）扩增的平末端PCR产物可直接连入克隆载体。连接产物可直接转化常用的大肠杆菌菌株。

试剂盒提供一个新颖的自杀基因阳性选择克隆载体pZERO-Blunt。该载体含有致死的自杀基因（内含多克隆位点），当载体与片段连接成功，自杀基因无法正确表达，包含重组子的细胞可以正常生长；当载体与片段连接不成功，载体自连后自杀基因正确表达，包含自连空载体的细胞无法存活，即“零背景”。这种阳性筛选策略无需蓝白斑筛选，极大地加速了克隆筛选进程。

为方便酶切作图和插入片段基因操作，pZERO-Blunt克隆载体的多克隆位点两侧各包含一个BglII识别序列。此外，该载体含有T7启动子，可用于体内或体外转录、插入片段测序等研究。

• 连接反应的准备：
  平末端PCR产物或者酶切后平末端片段可以通过琼脂糖凝胶电泳分离回收（使用长波紫外光下切胶或者可见光透射切胶避免DNA损伤造成连接失败）。与载体的摩尔比是3:1。本公司生产的DNA产物快速纯化回收试剂盒对70bp以上的DNA片段能很好地进行回收。
  
• 快速连接反应：
  
  • 在一个标准的10μL连接反应体系中，加入1μL 40ng pZERO-Blunt载体、X μl PCR产物(在通常状况下，没有必要对PCR产物进行精确定量，一般PCR产物与载体的摩尔比优化至1:1～10:1就可以得到良好结果，推荐3:1，见附录)、5μL 2×Quickligation Buffer和0.9μL的T4 DNA Ligase，其余用灭菌水补足。
    反应按以下体系进行：
    

    成分	用量
    2×Quick Ligation Buffer	5μL
    pZERO-Blunt载体	1μL
    纯化后的PCR产物/或者1μL 900bp control	X μL
    灭菌水	Y μL
    T4 DNA Ligase	0.9μL（5 Weiss Units/μl)
    总体积	10μL

    注：般最后加入T4 DNA Ligase。
    
  • 22℃连接5～10分钟（一般可在PCR仪器完成）。
    通常推荐22℃连接5～10分钟，>3kb长片段连接可以延长至30分钟。不推荐超过30分钟，超过可能降低转化子数量。
    
  • 冰上冷却，然后转化或贮存于-20℃。
• 转化：
  
  • 100μL感受态细胞，置于冰上，完全解冻后轻掸几次将细胞均匀悬浮。
    
  • 加入4～5μL连接液(最多可全部加入，只要连接液体积不超过感受态细胞体积的1/10)，轻轻混匀。冰上放置30分钟。
    
  • 42℃水浴热激90秒。冰上放置2～3分钟。
    
  • 加500μL LB或者SOC培养基(不含抗生素)，37℃ 150rpm振荡培养60分钟。
    
  • 将200μL细菌涂布在氨苄青霉素(100μg/mL)平板上。
    涂布细菌的用量依连接的效率及感受态细胞的感受率而进行适当的调整，如果预计的克隆较少，可通过离心（4000rpm，2分钟）后吸除部分培养液，留下适量的培养基悬浮菌体后取全部或者适量涂布于一个平板中（涂布剩余的菌液可以搁在4度保存，第2天如果转化菌落数量少，可将剩余菌液全部涂一个新培养板)。
    
  • 平板在37℃下正向放置1小时以吸收过多的液体，然后倒置培养过夜。
• 筛选：
  
  • 常规检测：将得到的菌落接种1～5mL LB（含有终浓度为100μg/mL的氨苄青霉素）培养基，37℃摇床振荡培养过夜，保存菌种后提取质粒，应用PCR或酶切方法鉴定插入片段是否正确。
    
  • 快速检测：挑取菌落直接进行PCR检测（可参见分子克隆第3版本或者参考本公司ALH351通用T载体菌落PCR鉴定试剂盒说明书）。
    
  • 测序鉴定：使用试剂盒自带引物或者T7启动子引物测序来确定是否含有目的克隆。

• 自带测序引物（暨菌落PCR引物）：
  forward sequencing primer,23-mer：5’-CGACTCACTATAGGGAGAGCGGC-3’
  reverse sequencing primer,24-mer：5’-AAGAACATCGATTTTCCATGGCAG-3’
  
  
• 如何计算连接反应中需要的PCR产物的量
  一般PCR产物与载体的摩尔比优化至1:1～10:1（推荐3:1）就可以得到良好结果，可采用以下公式：
  [加入载体的量（ng）×插入片段大小（kb）÷载体大小（kb）]×插入片段和载体的摩尔比=插入片段的量（ng）例如：插入片段和载体连接的摩尔比例为3:1，如连接反应中加入载体40ng，插入片段大小为500bp，这时应加入插入片段的量为[40ng载体×0.5kb插入片段÷2.974kb载体]×3/1=20.2ng。
  
  
• 载体信息：
  
  • pZERO-Blunt载体图谱：
    
    
  • pZERO-Blunt载体克隆位点序列：